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Cas9的稳转细胞株是什么?为什么要构建它?

  • 作者:admin
  • 发布时间:2019-12-19 13:09
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Cas9的稳转细胞株是什么?为什么要构建它?

一、什么是稳转细胞株?

是指在细胞中持续稳定地表达特定的基因,或者妨碍特定的基因的表达。细胞株目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上,在细胞中长期稳定表达。稳定表达细胞株弥补了瞬时感染(或转染)实验中中外源基因表达时间短的缺陷,便于长期观察。

二、什么时候需要构建稳转株?

1、长期在目的细胞中研究基因功能;

、一些蛋白半衰期极长,瞬时RNA只能干扰表达,不能去除已经表达的目标蛋白,希望实现更好的基因干扰效应

、选取复制数量适量的细胞进行实验研究,希望实验更加准确

、诱导表达系统主要需要致死基因或时空表达

、需要用细胞做动物实验的裸鼠肿瘤等。

三、CRISPR/Cas9基因敲除细胞株构建

用经典方法建立高产稳定细胞株依赖外源基因对宿主细胞基因组的随机整合,难以保证插入部位的表达水平和细胞株生长特性的稳定。

CRISPR/Cas9技术已经能够将感兴趣的目标基因定点整合到染色体基因组的特定部位。通过靶基因序列的确定、sgRNA表达质粒的构建、转染、流式细胞术阳性筛选、克隆扩大、基因分析等一系列操作,成功构建了稳定的细胞株。

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