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行业动态

sgRNA设计问题整理和解答

  • 作者:admin
  • 发布时间:2021-07-23 13:11
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    1.sgRNA设计在CDS区或是选择第一个或第二个外显子地区?
    答:(1)尽可能挑选靶向治疗全部转录本同用的外显子地区设计。由于原核生物的基因包括外显子和内含子,运用这种内含子和外显子,一个基因能够剪辑出好几个转录本,翻译后获得好几个蛋白质。设计条件性敲减的情况下,最先要弄清楚这一基因几个转录本,一般敲减全部转录本同用的外显子。
    (2)首先选择在基因的第一或第二外显子地区设计,以提升基因敲减高效率。
    2.有什么完全免费设计的网址或软件能够应用?
    答:
    (1)https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
    (2)http://chopchop.cbu.uib.no/
    (3)http://crispor.tefor.net/
    (4)www.rgenome.net/cas-designer/
    (5)http://zifit.partners.org/ZiFiT/
    (6)http://grna.ctegd.uga.edu
    (7)http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
    3.设计生成的sgRNA必须包括PAM序列吗?
    答:CRISPR序列是一个DNA序列(不包括PAM),在应用软件设计CRISPR序列时,必须将总体目标DNA序列(包含假设的PAM序列)都键入,要是没有PAM,就不太可能设计出CRISPR序列。
    sgRNA是RNA方式的分子结构,sgRNA正确引导C-as9靶向治疗鉴别CRISPR序列,在其中的PAM位点做为CRISPR序列在基因组下的一个标识,对Cas-9靶向治疗鉴别目地序列尤为重要,Cas-9的2个核苷酸内切酶结构域将PAM前的3-4核苷酸间的3'-5’磷酸二酯键断开,对目地基因开展编写。生成的sg-RNA中不包括PAM序列。
    4.挑选sgRNA是依照软件中得分由高到低考虑到吗?
    答:有一些设计网址的得分是根据科学研究毕业论文,但在数据信息样本数并不是很大的状况下,并不可以意味着在真正细胞株中的sg-RNA活力,因此高效率得分仅能做为参照。挑选crispr时,不可以在基因组里存有显著的脱靶部位的序列。
    正常情况下是甄选这些脱靶概率低的sg-RNA,分辨总体目标序列与备选脱靶序列的相似度,尽量选这些备选脱靶序列具3个mismatch的,随后再参照得分由高到低开展挑选。
    5.CRISPR序列是否一定要加G、A或GG?
    答:因为基因表达基因表达起止位点一边是以漂呤逐渐(主要是G,有时候为A),因此CRISPR序列一般以G开始。假如crispr(20nt)序列的前2nt是GG,在以T7启动子(前17nt)为推动的身体之外基因表达中,自然是最好是。假如crispr(20nt)并不是以G开始,能够加1-两个G,多了1-2G的sg-RNA被证实不危害spCas-9鉴别crispr序列的活力,但不可以合理正确引导espCas-9(正品保证版Cas-9)鉴别crispr序列。
    6.在同一个基因上设计两个sg-RNA,这两个sg-RNA间距有多远适合?
    答:假如试验目地是期待敲减这一基因,2个sgRNA中间的间距越近的越高,间距最多不必超出200bp。如果是期待在一个基因上生产制造出2个Indel基因突变位点,则提议距离200bp以外,越长越好。
    7.假如做RT-PCR认证,引物设计是否必须非特异对于设计s-gRNA相匹配的转录本?
    答:是的,必须设计非特异引物设计将靶向治疗基因突变部位的cDNA增加出去。因为基因组下基因组序列的更改很有可能会危害初始mRNA的剪辑,因而设计引物设计时,最好在总体目标序列的前边和后边的外显子上各自设计正反面向引物设计。
    8.是根据转录组测序結果核对sg-RNA周边的位点是不是发生基因突变,来分辨基因编写結果吗?
    答:DNA双解链一般发生在PAM位点前的3-4bp中间。非同源重组修补也产生在这里部位的周边,自然也会出现很大片段删掉的状况发生。
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