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行业动态

Cas13a酶活抑止体制的结构与作用科学研究

  • 作者:admin
  • 发布时间:2021-01-27 15:46
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    该科学研究表明了总体目标RNA的anti-tag序列与crRNA重复区产生的RNA发夹结构抑止Cas13a活性的分子结构体制。
    科学研究详细介绍
    病菌和古细菌运用多元化的CRISPR和CRISPR有关的(CRISPR-Cas)系统软件对于如噬菌体或别的外源性核苷酸开展适应性免疫。CRISPR系统软件近些年的开发设计运用已变成生物科技行业最引人注意的造就之一。这种方式又可以分成两类,以CRISPR-Cas-9/Cas12为意味着的,对于DNA的基因编辑技术方式,和以CRISPR-Cas13为意味着的,对于RNA的检验编写方式。
    这主要是因为Cas13能够在crRNA(一段20-30nt具备独特配对结构的RNA)在正确引导下,鉴别与crRNA配对的单链RNA(ssRNA)序列,进而激话RNase活性,接着不但酶切配对的ssRNA,还能够将周边非特异性的RNA底物开展酶切。这一特点历经合理设计方案和变大,能够运用于检验确诊方位,比如张峰试验室开发设计的SHERLOCK系统。
    科学研究結果
    这以前有关Cas13a的作用科学研究中,发觉当总体目标RNA靶向序列的中下游3’端能够与crRNA的tag地区持续配对时,对Cas13a的活性有明显抑制效果。与tag地区配对的靶向RNA上的序列称之为anti-tag,这一段序列能够避免 靶细胞Cas13系统的自身靶向,也为抑止Cas13活性的运用出示了很有可能的应用程序开发方位。
    本文最先在身体之外认证了靶向RNA的3‘端anti-tag的抑制效果(Fig1),对Leptotrichiashahii和Leptotrichiabuccalis二种Cas13a开展身体之外酶活和身体RNA干扰科学研究,发觉当总体目标RNA存有5nt之上anti-tag序列时,Cas13a对总体目标RNA和周边环境中的RNA的激光切割活性明显被抑止,对大肠埃希菌体细胞的RNA干扰活性也明显减少。
    科学研究工作人员另外分析了LshCas13a-crRNA一氧化氮合酶与anti-tagRNA融合的冷藏透射电镜(cryo-EM)结构。根据与现有的Cas13a-crRNA一氧化氮合酶和融合非靶向RNA的一氧化氮合酶结构的细致结构较为,加上身体体外实验的认证,表明了tag:anti-tag的配对抑止Cas13a酶催化反应活性的体制。
    从总体结构上看,因为融合了拓宽的tag:anti-tag配对结构,LshCas13蛋白质上融合双链RNA的地区增大,总体构象更为“顶开”,每个结构域中间都发生了显著的相对位移。尽管对比pre-target-bound构象(降解情况),总体结构转变显著,但参加RNA酶催化反应的重要碳水化合物R597、H602、R1278、H1283则基本上沒有产生显著偏移,全部催化反应袋子仍处在降解情况(Fig2)。而在激活状态结构中,HEPN-1的a-helicas发生了7-9埃的偏移,这种碳水化合物主链显著挨近,产生活性催化反应袋子(Fig3)。
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