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行业动态

构成和CRISPR-Cas13a系统的多样性

  • 作者:admin
  • 发布时间:2021-01-25 13:41
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    聚簇的标准间隔的短回文反复编码序列(CRISPR)-Cas13a,之前称之为CRISPR-C2c2,是近期评定出的以RNA正确引导的靶向治疗RNA的CRISPR-Cas系统,具备靶向治疗和附加的单链RNA(ssRNA)的与众不同特点)瓦解主题活动。该系统最先在沙氏淡皮细微革兰阴性杆菌中评定。在这儿,明确了11个Leptotrichia菌株的详细全基因组序列,并就CRISPR-Cas13a和别的CRISPR-Cas系统的构成,产生和多元性与18个公布能用的Leptotrichia基因开展了较为。发觉多种类型的CRISPR-Cas系统在Leptotrichia中遍布不均匀基因,包含IB型(10/29,34.4%),II-C(1/29,2.6%),III-A(6/29,15.4%),III-D(6/29,15.4%),类III(3/29,7.7%)和VI-A(11/29,37.9%),而八个菌株(20.5%)彻底沒有CRISPR-Cas系统。发觉Cas13a效用子高宽比基因变异,其氨基酸序列与沙希氏菌的相似度在61%至90%中间,可是传统了他们的附加ssRNA裂化特异性,进而阻拦了病菌的生长发育。CRISPR-Cas间隔区意味着了此前侵略者遭受的次序造就,保存的间隔区体现了菌株的进化系统生长发育或关联性。鞭毛虫间隔区的成分和总数剖析种群表明出非常大的多元性,仅有4.4%的间隔子(40/889)被2个菌株共享资源。由全部登记的瘦足菌属种群编号的CRISPR-Cas系统(I-VI型)的机构和遍布说明,CRISPR-Cas系统的效用子或间隔子序列差别非常大,I,III和VI型的发病率基本上同样相当于。仅有一种菌株带上II型,而沒有带上IV型或V型。这种結果出示了对Leptotrichia种群中CRISPR-Cas系统的特点和差别的新看法。
    细链霉菌菌株和生长发育标准
    三微绒毛trevisanii菌株,JMUB3870,JMUB3935和JMUB4039,二L.wadei菌株,JMUB3933和JMUB3934和一个L.中国香港红嘴鸥应变力,JMUB5056,从病人在日本血培养2012和2019之间隔离。微绒毛应变力JMUB3936于2017年在日本病人的支气管炎肺泡灌洗液中分离出来。下列型菌株微绒毛:从微生物菌种日本集(JCM)得到种群L.goodfellowiiJCM16774,L.hofstadiiJCM16775,L.shahiiJCM16776和L.wadeiJCM16777。细刺毛虫菌株在-80°C的标准下存储在配有40%凡士林的岐阜县厌氧发酵培养液(GAM骨头汤;NissuiPharmaceuticalCo.,Ltd.,日本日本东京)中,并在各种各样琼脂平板电脑上收购用以本科学研究,并分离出来出JCM12969在GAM琼脂上打疫苗了JCM16774,JMUB3933,JMUB3934,JMUB3935,JMUB4039和JMUB3870,在羊血琼脂上分离出来了JCM16775,JCM16776,JCM16777和JMUB3936(日本Sa玉县KohjinBioCo.,Ltd。)JMUB5056用小兔子血(日本日本东京的BectonDickinsonCompany,Ltd.)在AnaeroColumbia琼脂上生长发育。将全部平板电脑在5%CO2的标准下与吸氧剂(AnaeropackKenki,三菱煤层气有机化学企业,日本日本东京)在37°C下厌氧发酵孵育48-72h。大肠埃希菌M1601体细胞在Luria-Bertani(LB)培养液(日本BectonDickinsonCompany,Ltd.,日本东京,日本)中摇晃塑造,或在填补有抗菌素(氯霉素10μg/mL;卡那霉素50μg/mL)的LB琼脂上生长发育。质粒维护保养所需。
    质粒构建
    为了更好地查验干瘦克氏菌属种群的各种各样Cas13a基因座的附加生长发育抑止特异性,搭建了2组载体。一组用以表述CRISPR-C2c2,另一组用以形成其靶RNA。初始质粒pC003带有沙希氏菌Cas13a基因座。最先,根据聚合酶链反应(PCR)从每一个Leptotrichia菌种的基因中分离出来出包含纯天然立即反复编码序列和间距区的纯天然Cas13a基因座,随后应用In-FusionHD复制检测试剂盒更换shahiiC2c2基因座,将其复制到pC003载体中((日本滋贺县小宝宝生物公司),随后将载体的卡那霉素抗性基因更换为卡那霉素抗性基因(aphA-3)形成pKLC-C2c2。质粒pACYC184中包括的用以间距区复制的pC003-LshC2C2基因座是李波博士研究生的礼品(Addgene质粒#7915211;RRID:Addgene_79152)(Abudayyehetal。,2016)。

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