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行业动态

应用嵌合体DNA–RNA提高CRISPR–Cas12a的靶标特异性

  • 作者:admin
  • 发布时间:2021-01-08 15:43
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    CRISPR–Cas12a重组蛋白和嵌合体指导的制取
    针对Cas12a重组蛋白的纯化,的pET28a-Cas12a(碳水化合物革兰阴性杆菌属(AS)Cas12a,毛螺菌(LB)Cas12a,弗兰西斯新凶犯弗兰西斯菌(FN)Cas12a)病菌表达载体导进大肠杆菌BL21(DE3)种群开展转换,随后在37°C下塑造直到OD做到0.6。打疫苗IPTG两天后,沉定细菌细胞以去除培养液,并将剩下的体细胞沉定重悬在裂化缓冲液中[20mMTris-HCl(pH8.0),300mMNaCl,10mMβ-巯基乙醇,1%TritonX-100,1mMPMSF]。随后,根据超声波解决(冰,3分钟)毁坏病菌细胞质,并根据抽滤(5000rpm,十分钟)获得体细胞裂解物。针对一步纯化(在Cas12a的N端应用6xHis)纯化,将用洗涤缓冲液[20mMTris-HCl(pH8.0),300nMNaCl]预洗涤的Ni-NTA环氧树脂与超声波粉碎的体细胞内水溶液混和并在冷室(4℃)中拌和1小时三十分钟。细菌细胞沉定后根据用缓冲液B[20mMTris–HCl(pH8.0),300nMNaCl]洗涤10倍容积,洗脱缓冲液[20mMTris–HCl(pH8.0),300nMNaCl,200]去除非特异性融合成份mM咪唑]用以洗脱AsCas12a蛋白质。应用管理中心蛋白质(AmiconUltra)将用以蛋白洗脱的缓冲液互换为存储缓冲液[200mMNaCl,50mMHEPES(pH7.5),1mMDTT,40%凡士林],并储存在–80°C。针对二步纯化,将洗脱的蛋白与抗FLAG环氧树脂在冷室(4°C)中进一步孵育1小时三十分钟。再度用洗涤缓冲液[20mMTris-HCl(pH8.0),300nMNaCl]洗涤非特异性融合成份。洗涤后,应用洗脱缓冲液[20mMTris-HCl(pH8.0),300nMNaCl,3xFLAG肽(5mg/ml)]洗脱Cpf12a蛋白质。洗脱的缓冲液根据应用centricon(AmiconUltra,)互换成存储缓冲液[200mMNaCl,50mMHEPES(pH7.5),1mMDTT,40%凡士林],并在–80°C下存储。嵌合体DNA–RNA指导(bioneer)是依据每一个靶遗传基因中的靶编码序列分次生成的。
    基因DNA纯化
    将嵌合体(cr)RNA–DNA和资产重组Cpf1蛋白质一氧化氮合酶寄送至体细胞(HEK293FT)后两天,依据生产商的表明,应用基因DNA纯化检测试剂盒(Qiagen,DNeasyBlood&TissueKit)分离出来基因DNA。协议书。在质粒寄送的状况下,转染三天后获取基因DNA。
    靶向治疗扩增子转录组测序和数据统计分析
    应用相匹配于总体目标基因座的DNA引物设计制取PCR扩增子(DNMT1,HPRT1,RPL32P3,CCR5,FANCF,GRIN2B,EMX1)。随后,开展巢式PCR(转性:98°C–30s,引物设计淬火:58°C–30s,拉伸强度:72°C–30s,35个循环系统),以将对接子和数据库索引编码序列插进5'和扩增子的3'尾端(转性:98°C–30s,引物设计淬火:62°C–15s,拉伸强度:72°C–15s,35个循环系统)。以后,依据生产商的具体指导将标识的扩增子化合物上样至mini-SEQ检测仪(Illumina,SY-420-1001),并开展靶向治疗深层转录组测序。应用Cas-Analyzer剖析储存的Fastq文档,并测算插进高效率。
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