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行业动态

运用CRISPR/Cas12a取得成功爬取基因组大面积段

  • 作者:admin
  • 发布时间:2020-10-21 15:14
  • 点击:
天然产物(NPs)是药品先导化合物的关键来源于之一,立即从微生物菌种基因组中克隆微生物生成基因簇(BGCs)为发觉天然药物产生了颠覆性的更改。殊不知,针对BGCs很大(>80kb)的DNA片段,尤其是GC成分较高的链霉菌样版,高效率克隆依然是十分具备趣味性的,这也是发觉天然药物的短板。
现阶段,早已开发设计了各种各样用以BGCs克隆的技术性,包含由CRISPR/Cas9技术性衍化的几类新的克隆方式 。可是,作者觉得这种方式 都较为繁杂和用时,针对捕捉大中型的BGCs,尤其是高GC成分的BGCs,急需解决简易、迅速和高效率的对策,以开发设计纯天然生物活性小分子药物。
今日跟大伙儿共享的是谭高翼、张立新研究组运用CRISPR/Cas12a迅速立即捕捉基因组大面积段对策。doi:10.1101/2020.06.25.170191. 此项科学研究融合了CRISPR/Cas12a激光切割(例:高非特异、高灵便度)和病菌人力性染色体(BAC)百度文库搭建(例:DNA片段大,GC成分高)的优势,开发设计了一种简易,迅速,高效率的BGCs身体之外立即克隆方式 ,称之为CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediated fast direct biosynthetic gene cluster cloning)。作者不但取得成功从病菌人力性染色体或高GC(>70%)的链霉菌基因组DNA中高效率立即地克隆大面积段,还根据该对策捕捉了一个长达87kb的苏糖氟苯类物质基因簇(surugamies),并取得成功在无基因簇的链霉菌汽车底盘中表述和评定。
本科学研究将CRISPR/Cas12的DNA激光切割特异性与BAC百度文库搭建的特性紧密结合,开发设计了一种根据CRISPR/Cas12的BGCs克隆方式 —— CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediatedfast direct biosynthetic gene cluster cloning). 
① 捕捉质粒的搭建和CRISPR/Cas12酶切质粒
挑选并增加总体目标基因簇两边的同宗臂(每一个臂最少包括一个PAM结构域),随后将包括2个同宗臂和挑选标识(如:抗菌素抗性基因、抗菌药挑选遗传基因或lacZ)的BAC质粒框架,根据DNA拼装搭建成必须的捕捉质粒。在crRNAs的具体指导下,上下同宗臂的PAM地区被CRISPR/Cas12激光切割,产生线形捕捉质粒。
② 基因组DNA的分离出来和CRISPR/Cas12酶切基因组
制取总体目标菌种基因组(制取的genomic DNA plugs),随后在流程1中的crRNAs的具体指导下,运用CRISPR/Cas12对系统基因组DNA开展激光切割。
③ 联接和转换
混和流程1激光切割获得的线形捕捉质粒及其流程2酶切后的基因组DNA,应用T4 DNA ligase连接,随后根据电穿孔将联接物质导进大肠埃希菌E.coli,根据PCR认证挑选,从转换子中得到 总体目标基因簇。
作者评定和较为了各自由NEB约束性内切酶和CRSIPR/Cas12造成的二种不一样种类的黏连尾端所完成的克隆高效率。最先作者搭建了来自pCC2-FOS结合媒介(Epicentre)的质粒pGY2020,该质粒带有2个PAM结构域(PAM1和PAM2)和2个NEB约束性内切酶结构域(EcoRI和HindIII)。随后用CRISPR/Cas12或NEB酶切法将DNA片段(Amp)克隆到pGY2020中数据显示,根据CRISPR/Cas12的方式 获得的克隆数比根据NEB约束性内切酶的方式 低34%(P>0.05)。但二种克隆方式 的真检出率无显著性差异。表明CAT-FISHING能够以较高的高效率克隆总体目标DNA片段。
 
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