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行业动态

AID-Cas平台的构成

  • 作者:admin
  • 发布时间:2020-10-15 15:56
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AID-Cas平台由四个活性成分组成:变构探针、H1探针、H2探针和H3探针。变构探针是由三个功能域构成的ssDNA分子结构:用以EVs评定的CD63适体域(brown)、用以混种链式反应的H1起止域(深蓝色)和缺口域(翠绿色)。根据变构探针中2个相辅相成一部分间的混种,淬火后最后产生发夹结构。在H1探针中设计方案了三个功能域:H1驱动器融合域(深蓝色)、H2驱动器域(红色)和缺口域(翠绿色)。当鉴别缺口酶结构域的相辅相成编码序列(5'-CCTCAGC-3')存有时,缺口酶(BbvCI)会把它裁成缺口。H2探针由2个域构成:H2驱动器关联网站域(红色)和H3进行程序流程域(蓝紫色)。H3探针由RNA基因表达域、T7启动子区和H2启动子融合结构域域构成,能够基因表达Cas12a酶的crRNA。
AID-Cas平台的原理
(1)当EVs靶不会有时,变构探针处在非活性发夹结构中,H1引起域被阻隔,中下游反映无法启动。
(2)当总体目标EV存有时,变构探针中的CD63适体结构域能够 非特异地鉴别和融合到总体目标EV上。变构发夹结构(非激活状态)将被解除并转换到激活状态,根据释放出来H1引起域来起动事后发卡拼装。在H1和H2探针中间催化反应拼装发卡后,产生了变构探针、H1探针和H2探针构成的DNA分子一氧化氮合酶,并根据CD63适体吸咐在EVs表层。另外,释放出来的H3引起域进行了H3探针的发夹结构,并做为事后链延伸的引物设计。
然后,在DNA聚合酶的参加下,可以用下列模版转化成两根dsDNA链:由发夹结构变构探针和H1探针构成的循环系统链(C链),由发夹结构H2探针和H3探针构成的汇报链(R链)。释放出来的H1起止域能够 随意进行H1探针,起动新的增加循环系统,造成很多的R链。
随后,T7rna聚合酶能够 鉴别出R链上的T7启动子,并根据转录过程增加编码序列,造成好几个单链RNA(ssrna)。crRNA能够 根据二级结构的产生来鉴别Cas12a蛋白质,进而开发设计出CRISPR-Cas12a传感技术系统软件。
最终,运用现有的靶ssDNA,启动Cas12a/crRNA的反式切割工作能力,激光切割被FAM-BHQ1供体猝灭对抑止的ssDNA汇报探针,造成了变大的莹光数据信号来检验。
 
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