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行业动态

运用CRISPR/Cas12a取得成功抓取基因组大片段

  • 作者:admin
  • 发布时间:2020-10-05 15:21
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天然产物(NPs)是药品先导化合物的关键来源于之一,立即从微生物菌种基因组中复制微生物生成基因簇(BGCs)为发觉天然药物产生了颠覆性的更改。殊不知,针对BGCs很大(>80kb)的DNA片段,尤其是GC成分较高的链霉菌样版,高效率复制依然是十分具备趣味性的,这也是发觉天然药物的短板。
今日跟大伙儿共享的是科学研究工作人员新研究组运用CRISPR/Cas12a迅速立即捕获基因组大片段对策。doi:10.1101/2020.06.25.170191. 此项科学研究融合了CRISPR/Cas12a激光切割(例:高非特异、高灵便度)和病菌人力性染色体(BAC)百度文库搭建(例:DNA片段大,GC成分高)的优势,开发设计了一种简易,迅速,高效率的BGCs身体之外立即复制方式 ,称之为CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediated fast direct biosynthetic gene cluster cloning)。创作者不但取得成功从病菌人力性染色体或高GC(>70%)的链霉菌基因组DNA中高效率立即地复制大片段,还根据该对策捕获了一个长达87kb的苏糖氟苯类物质基因簇(surugamies),并取得成功在无基因簇的链霉菌汽车底盘中表述和评定。
科学研究将CRISPR/Cas12a的DNA激光切割特异性与BAC百度文库搭建的特性紧密结合,开发设计了一种根据CRISPR/Cas12a的BGCs复制方式 —— CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediatedfast direct biosynthetic gene cluster cloning),它的工作内容如【Figure1.】所显示,包括3个流程:
① 捕获质粒的搭建和CRISPR/Cas12a酶切质粒
挑选并增加总体目标基因簇两边的同宗臂(每一个臂最少包括一个PAM结构域),随后将包括2个同宗臂和挑选标识(如:抗菌素抗性基因、抗菌药挑选遗传基因或lacZ)的BAC质粒框架,根据DNA拼装搭建成必须的捕获质粒。在crRNAs的具体指导下,上下同宗臂的PAM地区被CRISPR/Cas12a激光切割,产生线形捕获质粒。
② 基因组DNA的分离出来和CRISPR/Cas12a酶切基因组
制取总体目标菌种基因组(制取的genomic DNA plugs),随后在流程1中的crRNAs的具体指导下,运用CRISPR/Cas12a对系统基因组DNA开展激光切割。
③ 联接和转换
混合流程1激光切割获得的线形捕获质粒及其流程2酶切后的基因组DNA,应用T4 DNA ligase连接,随后根据电穿孔将联接物质导进大肠杆菌E.coli,根据PCR认证挑选,从转换子中得到总体目标基因簇。
 
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