天然产物（NPs）是药品先导化合物的关键来源于之一，立即从微生物菌种基因组中复制微生物生成基因簇（BGCs）为发觉天然药物产生了颠覆性的更改。殊不知，针对BGCs很大（>80kb）的DNA片段，尤其是GC成分较高的链霉菌样版，高效率复制依然是十分具备趣味性的，这也是发觉天然药物的短板。

今日跟大伙儿共享的是科学研究工作人员新研究组运用CRISPR/Cas12a迅速立即捕获基因组大片段对策。doi:10.1101/2020.06.25.170191. 此项科学研究融合了CRISPR/Cas12a激光切割（例：高非特异、高灵便度）和病菌人力性染色体（BAC）百度文库搭建（例：DNA片段大，GC成分高）的优势，开发设计了一种简易，迅速，高效率的BGCs身体之外立即复制方式 ，称之为CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediated fast direct biosynthetic gene cluster cloning)。创作者不但取得成功从病菌人力性染色体或高GC(>70%)的链霉菌基因组DNA中高效率立即地复制大片段，还根据该对策捕获了一个长达87kb的苏糖氟苯类物质基因簇（surugamies），并取得成功在无基因簇的链霉菌汽车底盘中表述和评定。

科学研究将CRISPR/Cas12a的DNA激光切割特异性与BAC百度文库搭建的特性紧密结合，开发设计了一种根据CRISPR/Cas12a的BGCs复制方式 —— CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediatedfast direct biosynthetic gene cluster cloning),它的工作内容如【Figure1.】所显示，包括3个流程：

① 捕获质粒的搭建和CRISPR/Cas12a酶切质粒

挑选并增加总体目标基因簇两边的同宗臂(每一个臂最少包括一个PAM结构域)，随后将包括2个同宗臂和挑选标识(如：抗菌素抗性基因、抗菌药挑选遗传基因或lacZ)的BAC质粒框架，根据DNA拼装搭建成必须的捕获质粒。在crRNAs的具体指导下，上下同宗臂的PAM地区被CRISPR/Cas12a激光切割，产生线形捕获质粒。

② 基因组DNA的分离出来和CRISPR/Cas12a酶切基因组

制取总体目标菌种基因组（制取的genomic DNA plugs），随后在流程1中的crRNAs的具体指导下，运用CRISPR/Cas12a对系统基因组DNA开展激光切割。

③ 联接和转换

混合流程1激光切割获得的线形捕获质粒及其流程2酶切后的基因组DNA，应用T4 DNA ligase连接，随后根据电穿孔将联接物质导进大肠杆菌E.coli，根据PCR认证挑选，从转换子中得到总体目标基因簇。