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行业动态

sgRNA非特异融合

  • 作者:admin
  • 发布时间:2020-04-16 00:17
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sgRNA非特异融合
sgrna

一、非特异敲除的改进

sgRNA非特异融合引起的突变始终是一个难题,那麼这一难题是如何改进呢?

张峰团队想到了1个方式,即然两根链的破裂非常容易引起变,人们只让这条链断裂不可以了吗?而这条链的破裂又不能引起位点基因的突变,那麼添加2个引起单链破裂的酶不可以了吗?

事实上,这一念头是合理的,她们成功地把非特异减少了603000倍,并把这一技术称之为CRISPR Double Nickase,发至了《细胞》杂志期刊上。

二、CRISPR DOUBLE NICKASE 敲除的实际基本原理是啥?

和一般Cas9不一样的是,Cas9(Cas9 Nickase)上带1D10A的碳水化合物突变,这一突变促使Cas9已不造成DNA双链断裂和NHEJ修补(这种会招来突变的修补),只是会引起单链破裂和BER修补(这种不会引起突变的修补),左侧WT Cas9可切割双链,右面的Cas9 Nickase只能摘除1个链

运用Cas9 nickase只能进行单链裁切的特点,张峰团队想到把2Cas9 nickase相互功效在1个基因位点上,使其产生双链断裂(DSB),并非非特异融合则不会引起DSB,那样就减少了非特异突变。

2个只能切割单链的Cas9功效在邻近位点上,在该位点上产生DSB2cas9的间距要多远实际效果才最好呢?经过检测,团队发觉图为的offset-88bp之间引起的NHEJ最好。超出8bp100bp实际效果也可以。

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