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AkCas12b和BhCas12b

  • 作者:admin
  • 发布时间:2020-04-03 15:37
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AkCas12bBhCas12b
cas9

 

  有趣的是,这2个核酸酶在细胞系中也能检测到切断活性,插入缺损突变的比例不足1%。为了提高在细胞内的切割效率,研究人员首先优化了相应的sgRNA序列,发现BhCas12b的切割活性提高了30倍。研究人员进一步发现AkCas12bBhCas12b倾向于DNA的非靶链缺失,提示Cas12b结构相对紧凑,可能影响靶链进入RUC活性中心。AacCas12bDNA复合体的晶体结构揭示了RuvC活性中心与DNA基质相互作用的重要氨基酸。为了提高BhCas12bDNA的亲和力和切断活性,笔者测试了176个突变体,发现K846RS893R能显着提高切断活性。

  适冷酶表面富含甘氨酸,这增加了蛋白的柔性和酶活。为了进一步提高BhCas12b的酶活性,研究人员测试66BhCas12b表面的氨基酸取代甘氨酸突变体的酶活性,发现突变体e8337g(grna:位于DNA双链和RuvC活性中心之间)可提高至少2倍的酶活性。

  综上所述,研究人员构建了酶活性最高的突变体BHcas12bv4(k846r/s893r/e837g)(1)酶活性相当于SpCas9AsCas12a,但特异性高于SpCas9,安全性适合临床应用,(2)基因组内的PAM数为AsCas12a扩大了基因组靶向范围(3)蛋白质更小(BhCas12b:1108氨基酸,SpCas9:1369氨基酸,AsCas12a:1353氨基酸),尤其适合腺相关病毒AAV介导的基因治疗。因此,该系统具有极大的应用前景,有望开发出新一代安全高效的基因编辑工具。

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