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行业动态

在细胞系或生物模型中进行体内sgRNA检测

  • 作者:admin
  • 发布时间:2020-03-11 10:17
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在细胞系或生物模型中进行体内sgRNA检测
sgrna

 

在细胞系sgRNA检测

为了在细胞系中进行测试,可以使用你喜欢的转染方法,将sgRNACas9传递给细胞。一种好方法是将您的sgRNA克隆到包含相同Cas9基因、U6启动子和GFP报告的载体中(例如,可以在Addgene中使用Zheng实验室的Px458载体找到它)。转染后,检查细胞内的荧光水平,找到转染的细胞,培养细胞,提取DNA (不需要克隆,唯一需要评价的是sgRNA的效率)

在生物模型中的sgRNA检测,在模型生物体中测试的原理与细胞系的原理相同。

测试CRISPR/Cas9系统和sgRNA的最佳方法是通过电穿孔或微注射将复杂的sgRNACas9送入胚胎。你不一定要用质粒载体。例如,在小鼠胚胎中,你不需要将sgRNA克隆到质粒系统中。您可以使用Cas9 mRNA或蛋白与您的sgRNACas9sgRNA产后,在胚胎发育阶段,能够提取出足够的DNA产量。在小鼠中,通常是5天培养到囊胚阶段。从胚胎中提取DNA,用T7E1内切酶检测。或者,您可以使用桑格测序。测试sgRNA的效率相对容易在实验室实现。虽然在线预测工具已得到改进,但sgRNA的实际测试确保了编辑成功的最佳机会。

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