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行业动态

在细胞系或胚胎中进行体内sgRNA检测

  • 作者:admin
  • 发布时间:2020-03-03 11:33
  • 点击:

在细胞系或胚胎中进行体内sgRNA检测
sgrna

 

体内测试系统对于sgRNACas9酶的测试无疑更可靠。但是,由于需要执行克隆步骤,因此需要花费很长时间,几个小时内无法得到结果。

有很多方法可以测试你体内的sgRNA。您可以在组织培养的细胞系中或在模型生物体中测试引导。对于模型生物,你直接在胚胎中测试sgRNA,然后将胚胎培养到可以提取DNA进行基因分型和T7内切酶分析(T7E1)的阶段。

在细胞系

为了在细胞系中进行测试,可以使用你喜欢的转染方法,将sgRNACas9传递给细胞。一种好方法是将您的sgRNA克隆到包含相同Cas9基因、U6启动子和GFP报告的载体中(例如,可以在Addgene中使用Zheng实验室的Px458载体找到它)

转染后,检查细胞内的荧光水平,找到转染的细胞,培养细胞,提取DNA (不需要克隆,唯一需要评价的是sgRNA的效率)。使用PCR检查编辑使用T7E1化验。这个系统在细胞系中有许多变体。例如,质粒可以使用抗生素盒而不是GFP来选择转染细胞。

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