sgRNA的设计原则

　　1)sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统(SpCas 9)一般为20nt。

　　2)sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列为位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)，所以选择3'末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为30%-70%(40%-60%)。

　　3)sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。

　　4)如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。

　　5)全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，尽量不超过5个。

　　6)如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，尽量位于第一或第二外显子上。