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行业动态

地高辛标记探针

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    地高辛是一种类固醇激素的半抗原,又称之为异甲基洋地黄毒苷配基,大自然中仅在洋地黄绿色植物中发觉,因而别的生物中不带有抗地高辛的抗原,防止了选用别的半抗原作标记很有可能产生的环境难题。
    地高辛与抗地高辛抗原能产生免疫力融合,运用抗地高辛抗原上具有的酶标记就可开展探针的检验。
    选用人为办法能够将地高辛的线形间距臂与dUTP相互连接,产生DIG-11-dUTP,根据任意引物法或PCR法将其掺加到DNA中。
    RNA探针的标记是应用噬菌体信息内容编号的RNA聚合酶,根据身体之外基因表达将DIG-11-dUTP掺加到RNA探针中。
    寡核苷酸探针的标记则是根据尾端转移酶催化反应,在3'尾端再加上DIG-11-dUTP/dATP或DIG-11-ddUTP小尾巴。
地高辛标记探针(图1)
    地高辛标记核苷酸探针的关键标记方式
    DNA的标记方式
    PCR掺加法
    这类标记方式是根据聚合酶链反应,在Taq水解作用下,将DIG-11-dUTP掺加到新合成的DNA链中。
    以此方法标记的探针不仅敏感度高,生产量也很高。小量的基因DNA(1ng~50ng)便可同时根据PCR开展增加、标记。
    任意引物法
    用任意引物法可将DIG-11-dUTP标记于DNA链上。为获得最好标记实际效果,标记前模版DNA需要做线形解决,并且最少要用甲酸-乙醚开展一次dna提取,再用酒精沉积。
    100~10000碱基的模板链均可被合理地标记,但超过10000碱基的模板链则必须在标记前作限定酶切消化吸收。
    解决好的模版添加任意引物,按碱基相辅相成标准,任意引物与模版DNA淬火后由Klenow精彩片段从引物3'端拓宽引物,便可将DIG-11-dUTP匀称掺加到新合成的DNA链中。
    创口移动法
    创口移动法DNA技术性迅速简单,且已十分完善。先用少量的DNaseI在双链DNA上开启多个多肽链空缺,
    随后在E.coliDNA聚合酶I的5'-3'外切活力和汇聚活力的相同的作用下,在空缺的5'端摘除单链DNA编码序列,随着由新合成的含有地高辛标记的脱氧核苷酸链替代。
    此方法适用环状DNA或超过1kbDNA精彩片段的标记。用以原位杂交的核苷酸探针,根据创口移动法标记更为合理。
    由于此办法可利用操纵DNaseI的酶促反应获得合理的空缺,进而获得长短尺寸合适的探针,而探针的高低是原位杂交的一个关键主要参数,充足小的探针才很有可能透过机构或体细胞。
    寡核苷酸探针的标记方式
    生成的寡核苷酸探针被普遍使用于挑选基因文库、Southern印痕、Northern印痕、斑点印迹及原位杂交实验。
    地高辛标记寡核苷酸有三种方式:3'尾端标记、5'尾端标记及其在探针3'端再加上多个DIG-11-dUTP分子结构的小尾巴。
    3'尾端标记法
    3'尾端标记法的主要特点是在每一个生成的寡核苷酸(长短为14~100bp)的3'尾端只加上一个地高辛残基(DIG-ddUTP)。
    用此方式标记寡核苷酸时,除尾端转移酶外,不用其他非常的寡核苷酸生成实验试剂,省时省力。
    所生成的探针合适于规定探针具备较高的非特异而敏感度一般的实验,如Southern印痕、Northern印痕、斑点印迹及菌体P噬牙斑菌混种杂交试验。
    5'尾端标记法
    5'尾端标记法是根据有机化学办法将地高辛标记于寡核苷酸的5'尾端。最先在5'尾端联接上一个羟基联接臂残基,将生成的寡核苷酸提纯后,再使DIG-NHS与5'尾端的羟基残基产生共价键融合,进而产生标记探针。
    这类探针的一个关键优势是其3'端在DNA生成反映中当做引物,使反映物质得到标记。
    3'尾端加尾法
    3'尾端加尾法是由尾端转移酶在探针3'尾端再加上多个地高辛残基的小尾巴。此方式标记的探针敏感度较3'尾端标记法要高于10倍上下,但因为存有尾巴,通常会产生较明显的非特异性情况。
    RNA探针的标记方式
    根据RNA聚合酶SP6、T7或T3经身体之外基因表达可将地高辛标记于RNA探针上。用地高辛标记的RNA探针具备较强的数据信号工作能力,且非特异性情况少,
    在Southern印痕和Northern印痕试验中,实际效果显著好于同是地高辛标记的DNA,可与放射性物质放射性核素标记探针相提并论。
    此外,在挑选菌体P噬牙斑菌及原位杂交的试验中,RNA探针也一样有着优良的实际效果。并且,因为DIG与UTP中间的键合对偏碱不比较敏感,可根据碱解决方式获得所需尺寸的探针。
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