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改进tRNA-sgRNA融合体提高解脂耶氏酵母基因编写高效率

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    解脂耶氏酵母是一种关键的工程项目菌种,在生产制造多种多样特殊化学物质层面具备极大的运用发展潜力。殊不知,解脂耶氏酵母在同宗DNA受体的修补及同源重组层面主要表现不佳,这就限定了对该类菌开展结构域非特异基因编辑技术。近些年有科学研究运用tRNA-sgRNA融合体并根据CRISPR-Cas-9技术性取得成功完成了对解脂耶氏酵母一些基因结构域的编写。tRNA-sgRNA融合体具备两大层面的优点:一方面tRNA能够推动sgRNA的表述;另一方面应用tRNA做为启动子推动sg-RNA的表述,清除了在cr-RNA的5‘端加上G或GG多肽链的必须。殊不知,tRNA-sg-RNA融合体系统遭受编写通过率及高效率不高难题的困惑。
改进tRNA-sgRNA融合体提高解脂耶氏酵母基因编写高效率(图1)
    近日,美国普林斯顿大学的GregoryStephanopoulos研究组在国际性刊物MetabolicEngineering发布了名为ImprovingCRISPR/Cas-9-mediatedgenomeeditingefficiencyinYarrowialipolyticausingdirecttRNA-sgRNAfusions的文章内容。该研究组最先对现阶段设计方案出的tRNA-sg-RNA融合体开展了综合性较为,发觉sg-RNA5’端存有一段9个多肽链且含有胸腺嘧啶的沉余遗传基因间序列,从而对有没有这一段序列的sgRNA二级结构开展了模型预测分析。结果显示,这一段不必要的序列会搅乱tracr-RNA的重要二级结构正本或造成cr-RNA发生结构,从而危害了sg-RNA的活力或减少了sg-RNA的工作效能。以后,该研究组在先人科学研究的基本上设计方案了二种对于不一样遗传基因靶标且缺乏这一段序列的tRNA-sgRNA融合体(TG)并与原融合体(T9G)开展了sgRNA二级结构层面的较为,具体观查到9多肽链序列的存有会造成茎环构造振荡等以前模型预测的結果,缺乏此段序列的tRNA-sg-RNA融合体对比原融合体在遗传基因敲入与基因敲除的高效率上均有不一样水平的提高。在这个基础上,该研究组对同源重组修补模版与sg-RNA的设计方案给予了新看法。
    该科学研究提升了原来tRNA-sg-RNA融合体基因编辑技术通过率与高效率不高的短板,为tRNA-sg-RNA融合体的合理设计方案给予了新的角度,有希望推动解脂耶氏酵母在代谢工程层面的运用。
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