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行业动态

RNA探针的生成方式和生成高效率检测

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    在RNA的杂交检测试验中,运用标记的RNA探针将得到高灵敏的杂交检测結果,与DNA探针对比,检测敏感度提升10-100倍。由于针对不一样的杂交体种类而言,RNA-RNA杂交体的融合抗压强度高过RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。针对根据Northernblots检测较低浓度的mRNA,及其原点杂交的核苷酸精准定位检测等运用,RNA探针是一种理想化挑选。可是,在RNA探针制取过程和全部杂交试验全过程中,务必留意RNAse的污染治理实际操作。
    制取RNA探针的常见方式是搭建含探针标记模板的重组质粒,将复制子的转录区中下游开展约束性酶切线性化后,开展身体之外转录的探针生成反映。自然,选用的质粒上务必带有SP6,T3或T7RNA 、聚合酶的启动子编码序列。身体之外转录法生成的探针量非常大,一般状况下,1μg的DNA模板开展反映,将获得20μg的标记RNA 、探针。
    另一种更为立即的身体之外转录标记法,是先根据PCR方式制取DNA探针模板。扩增引物必须独特设计方案,包括SP6,T3或T7RNA、聚合酶的启动子编码序列。
    针对原点杂交的运用,为了更好地能够更好地开展杂交反映的质量控制,提议在制取反义链探针的另外,也制取公平正义链的探针,作为杂交试验的阴性对照。在原点杂交试验前,最先根据Northernblots试验认证探针的实效性和总体目标转录子在不一样样版中的表述方式,有利于简单化事后原点杂交试验的提升步骤和結果表述。
RNA探针的生成方式和生成高效率检测(图1)
    模板制取和探针标记
    以地高辛(DIG)的探针标记方式为例子,罗氏DIGNorthernStarterKit的操作说明中提议,假如立即根据PCR方式制取DNA探针模板,反义链端反方向扩增引物应包含T7RNA、聚合酶的启动子编码序列5'-AATACGACTCACTATAGG-3'(事后根据T7RNA转录),或T3启动子编码序列5'-ATTAACCCTCACTAAAGG-3'(根据T3RNA转录)。
    根据此方式得到的特殊PCR物质,不用历经提纯,就可以用以中下游探针生成。针对地高辛标记系统软件,在身体之外转录生成的探针精彩片段中,大概每过3个UTP结构域会插进一个DIG标记的UTP分子结构(DIG-11-UTP)。多肽链混和底物中未标记UTP和DIG-11-UTP的占比很重要,由于在应用地高辛抗原开展含DIG的杂交体的检测时,探针上插进的DIG分子结构需排列在一个适合的室内空间位阻范畴,以利于抗原的成功融合,并得到高灵敏的检测数据信号。
RNA探针的生成方式和生成高效率检测(图2)
    探针标记剖析和敏感度检测
    DIG标记的RNA、探针能够根据琼脂糖电泳电泳原理检测其精彩片段长短和纯净度。如未标记的同样RNA编码序列较为,因为DIG分子结构的插进,被标记的RNA可能在泳道中展现含量的转变。
    在开展杂交试验前,检验站生成探针的敏感度是十分关键的一个流程,是开展试验提升和得到精确性杂交結果的前提条件。过高的探针浓度值将造成高杂交情况,过低的探针浓度值将促使杂交数据信号减弱乃至缺少。
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