欢迎来到广州博徕斯生物科技股份有限公司

博徕斯生物,高技术,高质量,高性价比

国内最全的基因编辑(cas系列)蛋白种类提供商

咨询热线:

189-2400-9712

{dede:global.cfg_gongsi/}

主页 > 新闻资讯 > 行业动态

联系我们

手机:189-2400-9712

邮箱:service@bio-lifesci.com

地址:广州高新技术产业开发区科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器A802房

行业动态

裂变酵母中的CRISPR–Cas12a系统

  • 发布时间:
  • 点击:
 
CRISPR–Cas12a是具备RNase和DNase特异性的II类V型簇状标准间距短回文反复序列(CRISPR)系统。
裂变酵母中的CRISPR–Cas12a系统(图1)
表述FnCas12a和crRNA以在裂变酵母中开展基因组编辑
来源于不一样种群的很多Cas12a(也称之为Cpf1)大家族蛋白质已运用于基因组编辑。在其中,三种Cpf1组合应用最普遍的:FnCpf1从弗兰西斯新凶犯弗兰西斯菌U112,从AsCpf1碳水化合物革兰阴性杆菌属。脑膜炎奈瑟菌病菌ND2006的BV3L6和LbCpf1 。这种组合具备类似的crRNA生产加工和基因组编辑作用,他们的立即反复序列也显示信息出高质量的开放阅读框。在制酒酵母中,FnCas12a(也称之为FnCpf1)具备对比AsCpf1和LbCpf1(高效率的基因组编辑特异性和低毒性40,43)。根据这种特点,大家挑选了FnCpf1在裂变酵母中搭建CRISPR–Cpf1系统。
为了更好地完成合理的基因组编辑并降低酵母转换的难度系数,大家将含有crRNA的FnCpf1拼装成一个含有ura4标识的质粒。结果显示,这类单质粒对策针对裂变酵母中的CRISPR-Cas-9系统更合理。FnCpf1应用构成型adh1启动子表述,而crRNA最开始应用rrk1启动子表述,接着在3'端应用Hammerhead核酶表述。该控制模块还用以CRISPR–Cas-9系统中,以保证 具备精准尾端的crRNA完善。
Cas12a基因组编辑系统软件。(A)从裂变酵母中具备ura4标识和ars1拷贝起始点的单独质粒表述FnCpf1和crRNA。做为第一个搭建体,FnCpf1和gRNA各自与adh1和rrk1启动子一起表述。(B)为了更好地检测编辑高效率,大家挑选了四个靶向治疗内源ade6   CDS的gRNA。根据同源重组共转化一种线形肾源DNA以缺少ade6。(C)常用的gRNA序列以及编辑高效率(均值±SEM)初始菌落计数列于填补表S6。(D)菌体PCR查验含有低腺嘌呤培养液的PMG5-Ura平板电脑中鲜红色菌体和白菌体中的ade6缺少。来源于NEB(文件目录号N3200L)的1kb Plus DNA梯被作为含量规范。(E)在平板电脑上维护保养以查验腺嘌呤营养成分缺点型。
裂变酵母中的CRISPR–Cas12a系统(图2)
检测PAM喜好和CRISPR–Cpf1的别的靶点编辑
大家还查验了裂变酵母中FnCpf1的PAM序列喜好。之前,FnCpf1的PAM界定为5'-TTN-3',可完成身体之外合理的DNA裂化特异性。可是最少在制酒酵母中,FnCpf1具备5'-TTTV-3'(V = A,G或C)对身体基因组编辑的明显喜好。查验Sch.FnCpf1的PAM首选项。pombe,大家根据将同义词点突变引进ade6CDS来装饰同样gRNA靶点的PAM序列。結果,含有取代PAM的酵母菌种具备同样的gRNA序列和作用同样的Ade6蛋白质。大家观查到,应用TTTV的PAM,FnCas12a做到了相对性较高的编辑高效率,应用TTTT时,该高效率骤降到仅有7%上下。针对PAM CTTA,鲜红色菌体占比降低了一半,在其中大部分菌体事实上是因为失效的基因组编辑而造成 的嵌合体。当PAM序列合乎TTTV时,未观查到这类菌体。总而言之,针对裂变酵母中的身体基因组编辑,FnCpf1好像更喜欢TTTV的PAM序列,而且在设计方案gRNA时要遵照该标准。
在线客服
联系方式

热线电话

189-2400-9712

上班时间

周一到周五

公司电话

线