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行业动态

CRISPR-Cas12a辅助核酸检测

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    如今,在诸如人类基因分型和病原体检测等领域,对高效且经济高效的核酸检测方法的需求仍在增长。使用合成的生物分子成分,已经开发出许多方法来快速检测核酸1、2、3;以及但是,它们可能无法同时满足特异性,敏感性,速度,成本和简便性要求。最近,基于基于RNA的靶向RNA的CRISPR效应子Cas13的a4的附带效应,已经建立了非常有前途的基于CRISPR的诊断(CRISPR-Dx)(即SHERLOCK)。SHERLOCK具有高灵敏度和特异性,在检测目标RNA时非常方便。但是,要检测DNA序列,必须在SHERLOCK试验之前将DNA体外转录成RNA,这可能非常不方便。
    Cas12a可快速检测目标DNA和目标RNA
    在最近的一项研究中,我们发现Cas12a(属于2类VACRISPR-Cas系统5)在形成Cas12a/crRNA/靶DNA三元复合物时会切断非靶ssDNA的侧链。在此,我们利用荧光淬灭的报告分子单链DNA(例如HEX-N12-BHQ1补充表S1)作为探针,并开发了HOLMES(单个HOUR大流量成本中等高用途ËHigh-效率S系统),可用于快速检测目标DNA和目标RNA。在HOLM​​ES中,如果反应系统中存在目标DNA,则Cas12a/crRNA二元复合物与目标DNA形成三元复合物,然后该三元复合物将反切系统中的非目标ssDNA报告基因,以便照亮十六进制荧光(或任何其他种类的其他荧光)。
CRISPR-Cas12a辅助核酸检测(图1)
    Cas12a纯化蛋白
    我们纯化了十个Cas12a蛋白,发现它们都显示出ssDNA反式切割活性6。为了找到最适合HOLMES的Cpf1(即具有高信噪比),我们测试了所有十种Cpf1蛋白,发现了ND2006Cpf1(LbCpf1)Oribacteriumsp.。NK2B42Cpf1(OsCpf1),钩端螺旋体细菌NC2008Cpf1(Lb5Cpf1)和Francistularensisular12(FnCpf1)表现良好,选择LbCpf1进行以下研究。为了确定HOLMES的敏感性,我们对目标DNA进行了滴定,发现Cpf1-crRNA的最低可检测浓度约为0.1nM。但是,当与PCR结合使用时,可检测浓度可能低至10aM,相当于SHERLOCK系统4。并且它比单独使用PCR或使用SYBRGreen方法的定量PCR更好。因此,为了获得更高的灵敏度,随后在S检验中使用了PCR扩增。
CRISPR-Cas12a辅助核酸检测(图2)
    轻松检测人类SNP基因型
    我们选择了十二个与人类健康和个人特征有关的SNP位点。我们要么从培养的人类293T细胞中提取基因组DNA,要么从人类个体中收集唾液,然后PCR扩增目标区域,然后进行HOLMES分析以区分等位基因。结果清楚地表明,特异性足够高,可以确定纯合和杂合基因型。我们还从19名志愿者那里收集了唾液样本,以检测与痛风风险有关的SNPrs1014290,并证明其可用于快速,轻松地检测人类SNP基因型。
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