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行业动态

基于CRISPR-Cas12a的多色可视化技术可检测转基因作物(GMO)中的外源NOS

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    本文摘要
    在这项研究中,作者为转基因生物建立了一个基于CRISPR-Cas12a的便携式视觉检测平台,该平台依靠转化酶-葡萄糖氧化酶级联反应和Fenton反应引起的金纳米棒的颜色变化来可视化检测信号。检测靶基因是胭脂碱合酶终止子(T-NOS),其是转基因生物的外源基因中普遍存在的模型靶。通过重组酶辅助扩增,该平台可实现与荧光报告基因分析(1aM)相当的DNA靶基因敏感性。通过视觉识别,可以目测Bt-11玉米中的GMO含量低至0.1wt%,并且通过测量GMO成分的吸收,可以得到0.1-40范围内的半定量GMO成分。重量%。该平台工艺简单,不需要大型或专用仪器,灵敏度高,选择性好。它可以有效地区分实际的转基因样品。该平台有望为转基因生物的安全监管提供合理的技术支持。
基于CRISPR-Cas12a的多色可视化技术可检测转基因作物(GMO)中的外源NOS(图1)
    这项研究的意义
    随着转基因技术的发展和转基因作物的持续商业化,转基因不仅给世界带来了巨大的经济,环境和农业利益,同时还带来了不确定的生物安全性,尤其是食品安全。转基因作物也受到了影响。前所未有的高度关注。
    目前,检测外源基因(35S,T-NOS)及其在转基因生物(GMO)中的表达产物仍离不开专业设备和熟练操作人员。
    尽管基于CRISPR系统的核酸检测显着提高了核酸检测的灵敏度和特异性,但它从未能够实现遗传修饰检测中集成,快速和可见的检测技术突破。
    本文基于吸收光谱中独特的侧面等离振子共振(TSPR)和纵向表面等离振子共振(LSPR)模式,使用不同长宽比的金纳米棒(GNR)的色差来实现多色视觉检测底物。
基于CRISPR-Cas12a的多色可视化技术可检测转基因作物(GMO)中的外源NOS(图2)
    CRISPR-Cas12a可视化生物传感器的工作原理
    原理:(1)首先,通过高灵敏度重组酶辅助(RAA)扩增样品中的NOS终止子,以产生高拷贝数的靶DNA。然后,将导入的靶DNA与crRNA杂交以触发CRISPRCas12a系统的反式切割活性。(2)接着,活化的Cas12a切割MB与蔗糖酶之间的ssDNA连接,并且游离蔗糖酶与活化Cas12a的靶基因的浓度正相关。(3)磁化除去残留的MBs后,上清液中释放的转化酶进行级联反应以催化蔗糖水解,产生的葡萄糖立即被GOx氧化生成H2O2。在酸性环境中,Fe2引发的Fenton反应迅速将H2O2转化为反应性中间体(.OH)。(4)最后,由于CTAB的保护,GNR主要沿纵轴被羟基蚀刻,并且由此引起的纵横比的显着变化导致溶液的色差。最终颜色与目标DNA的原始含量有效相关,并且可以通过肉眼轻松区分。此外,LSPR频移的峰值波长可用于通过紫外可见分光光度法对目标DNA进行半定量。
    基于Cas12a的NOS终止子检测系统的灵敏度
    作者使用了2uL不同浓度的NOS终止剂样品(400、100、50、5、0.5、0.05、0.01和0mM)。每3分钟测量一次荧光强度,表明dsDNA靶基因的浓度与Cas12a反式切割活性的荧光强度呈正相关。与空白组相比,具有0.05nMdsDNA的靶基因组仍显示出荧光强度的显着差异(*P<0.05),表明-Cas12a的检测灵敏度低至0.05nM,未进行任何扩增。
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