天然产物（NPs）是药品先导化合物的关键来源于之一，立即从微生物菌种基因组中克隆微生物生成基因簇（BGCs）为发觉天然药物产生了颠覆性的更改。殊不知，针对BGCs很大（>80kb）的DNA片段，尤其是GC成分较高的链霉菌样版，高效率克隆依然是十分具备趣味性的，这也是发觉天然药物的短板。

  现阶段，早已开发设计了各种各样用以BGCs克隆的技术性，包含由CRISPR/Cas9技术性衍化的几类新的克隆方式。可是，创作者觉得这种方式都较为繁杂和用时，针对捕捉大中型的BGCs，尤其是高GC成分的BGCs，急需解决简易、迅速和高效率的对策，以开发设计纯天然生物活性小分子药物。

  今日跟大家共享的是谭高翼、张立新研究组利用CRISPR/Cas12a迅速立即捕捉基因组大面积段对策。doi:10.1101/2020.06.25.170191. 此项科学研究融合了CRISPR/Cas12a激光切割（例：高非特异、高灵便度）和病菌人力性染色体（BAC）百度文库搭建（例：DNA片段大，GC成分高）的优势，开发设计了一种简易，迅速，高效率的BGCs身体之外立即克隆方式，称之为CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediated fast direct biosynthetic gene cluster cloning)。创作者不但取得成功从病菌人力性染色体或高GC(>70%)的链霉菌基因组DNA中高效率立即地克隆大面积段，还根据该对策捕捉了一个长达87kb的苏糖氟苯类物质基因簇（surugamies），并取得成功在无基因簇的链霉菌汽车底盘中表述和评定。

  本科学研究将CRISPR/Cas12a的DNA激光切割特异性与BAC百度文库搭建的特性紧密结合，开发设计了一种根据CRISPR/Cas12a的BGCs克隆方式—— CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediatedfast direct biosynthetic gene cluster cloning). （事实上便是利用Cas12a切出来的粘性末端开展联接）它的工作内容包括3个流程：

  ① 捕捉质粒的搭建和CRISPR/Cas12a酶切质粒

  挑选并增加总体目标基因簇两边的同宗臂(每一个臂最少包括一个PAM结构域)，随后将包括2个同宗臂和挑选标识(如：抗菌素抗性基因、抗菌药挑选遗传基因或lacZ)的BAC质粒框架，根据DNA拼装搭建成必须的捕捉质粒。在crRNAs的具体指导下，上下同宗臂的PAM地区被CRISPR/Cas12a激光切割，产生线形捕捉质粒。

  ② 基因组DNA的分离出来和CRISPR/Cas12a酶切基因组

  制取总体目标菌种基因组（制取的genomic DNA plugs），随后在流程1中的crRNAs的具体指导下，利用CRISPR/Cas12a对系统基因组DNA开展激光切割。

  ③ 联接和转换

  混和流程1激光切割获得的线形捕捉质粒及其流程2酶切后的基因组DNA，应用T4 DNA ligase连接，随后根据电穿孔将联接物质导进大肠杆菌E.coli，根据PCR认证挑选，从转换子中得到 总体目标基因簇。

  创作者评定和较为了各自由NEB约束性内切酶和CRSIPR/Cas12a造成的二种不一样种类的黏连尾端所完成的克隆高效率。最先创作者搭建了来自pCC2-FOS结合媒介(Epicentre)的质粒pGY2020，该质粒带有2个PAM结构域(PAM1和PAM2)和2个NEB约束性内切酶结构域(EcoRI和HindIII)。随后用            CRISPR/Cas12a或NEB酶切法将DNA片段（Amp）克隆到pGY2020中。数据显示，根据CRISPR/Cas12a的方式获得的克隆数比根据NEB约束性内切酶的方式低34%(P>0.05)。但二种克隆方式的真检出率无显著性差异。表明CAT-FISHING能够以较高的高效率克隆总体目标DNA片段。